熒光定量PCR是在傳統(tǒng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)具有里程碑意義的核酸定量技術(shù)。它通過在PCR反應(yīng)體系中引入熒光化學(xué)物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA擴(kuò)增過程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和精準(zhǔn)定量，解決了傳統(tǒng)PCR只能終點(diǎn)檢測(cè)、無法準(zhǔn)確定量的局限。自1996年定量PCR儀問世以來，該技術(shù)憑借其高靈敏度、強(qiáng)特異性、寬線性范圍和低污染風(fēng)險(xiǎn)等優(yōu)勢(shì)，迅速成為分子生物學(xué)研究、臨床診斷、病原體檢測(cè)和基因表達(dá)分析等領(lǐng)域的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法。
 

　　一、原理
 

　　這是一種以熒光信號(hào)為基礎(chǔ)的PCR技術(shù)，它是利用熒光染料標(biāo)記的靶分子在PCR反應(yīng)過程中的特異性擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)DNA分子定量分析的一種方法。
 

　　熒光定量PCR分為兩種方法：染料法和探針法。是一種結(jié)合雙鏈DNA的染料，它在PCR反應(yīng)過程中結(jié)合到擴(kuò)增產(chǎn)物中，產(chǎn)生特異性熒光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)的熒光定量。探針法是利用特殊的探針標(biāo)記目標(biāo)序列，這種探針在熒光棒上加有熒光基團(tuán)，只有在PCR反應(yīng)的溫度高于探針的脫離溫度時(shí)，才能與目標(biāo)序列特異性雜交并釋放熒光信號(hào)，其子類包括TaqMan探針、分子信標(biāo)探針和通量探針等。
 

　　二、技術(shù)方法
 

　　1.樣本的制備
 

　　需要進(jìn)行精細(xì)樣品制備，樣品制備方式與檢測(cè)目的密切相關(guān)。例如，如果是檢測(cè)基因的表達(dá)水平，需要提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，如果要檢測(cè)特定DNA序列，可以用PCR擴(kuò)增獲取擴(kuò)增產(chǎn)物，并進(jìn)行目標(biāo)序列的純化或酶切等操作。
 

　　2.PCR反應(yīng)體系的制備
 

　　PCR反應(yīng)體系的制備需要注意靈敏度和特異性，并且需要進(jìn)行良好的優(yōu)化。體系包括模板、引物、酶和緩沖液等。引物是qPCR的關(guān)鍵部分，它必須能夠牢固地結(jié)合到樣品DNA上，擴(kuò)增出特定的擴(kuò)增產(chǎn)物。緩沖液用于維持PCR反應(yīng)體系的pH和離子強(qiáng)度，酶則是擴(kuò)增產(chǎn)物的生成催化劑。
 

　　3.PCR反應(yīng)過程
 

　　PCR反應(yīng)過程分為三個(gè)階段：變性、退火和延伸。擴(kuò)增參數(shù)如溫度和時(shí)間等會(huì)影響PCR效率和特異性，溫度和時(shí)間要根據(jù)反應(yīng)體系優(yōu)化。
 

　　4.數(shù)據(jù)分析和結(jié)果的解釋
 

　　結(jié)果需要通過熒光曲線得到，并在以標(biāo)準(zhǔn)曲線為基礎(chǔ)的測(cè)量下，通過一系列的基因表達(dá)分析軟件進(jìn)行分析。
 

　　三、主要熒光化學(xué)體系
 

　　根據(jù)熒光信號(hào)產(chǎn)生機(jī)制的不同，qPCR主要分為兩大類：非特異的熒光染料法和特異的熒光探針法。
 

　　1. SYBR Green I 染料法
 

　　SYBR Green I是一種能夠非特異性結(jié)合于雙鏈DNA小溝的熒光染料。在游離狀態(tài)下，其熒光信號(hào)極其微弱；一旦與雙鏈DNA結(jié)合，熒光信號(hào)會(huì)增強(qiáng)數(shù)百甚至上千倍。隨著每個(gè)循環(huán)PCR產(chǎn)物的倍增，結(jié)合到DNA上的染料分子增多，熒光強(qiáng)度也隨之成比例上升。
 

　　這種方法的優(yōu)點(diǎn)是通用性好、成本低廉，無需針對(duì)每個(gè)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)特異性探針，只需合成一對(duì)引物即可開展實(shí)驗(yàn)，適合進(jìn)行初步的基因表達(dá)篩查或驗(yàn)證。然而，其局限性在于缺乏序列特異性。任何雙鏈DNA，包括引物二聚體或非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，都會(huì)被染料檢測(cè)并貢獻(xiàn)熒光信號(hào)，可能導(dǎo)致定量結(jié)果偏高。因此，染料法實(shí)驗(yàn)必須進(jìn)行熔解曲線分析。通過擴(kuò)增結(jié)束后緩慢升溫，觀察熒光信號(hào)的下降曲線，根據(jù)熔解峰的峰形和數(shù)量判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。單一尖銳的熔解峰代表特異性產(chǎn)物，而出現(xiàn)雙峰或?qū)挿鍎t提示可能存在非特異性擴(kuò)增。
 

　　2. TaqMan 探針法
 

　　TaqMan探針法利用的是熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)原理，具有更高的特異性。探針是一段與目標(biāo)序列內(nèi)部區(qū)域互補(bǔ)的寡核苷酸，其5'端標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)(如FAM)，3'端標(biāo)記一個(gè)淬滅基團(tuán)(如TAMRA)。當(dāng)探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)距離極近，報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光被淬滅基團(tuán)吸收，檢測(cè)不到信號(hào)。在PCR延伸階段，Taq DNA聚合酶利用其5'→3'外切酶活性，遇到結(jié)合在模板上的探針時(shí)將其水解切割。報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，熒光信號(hào)得以釋放并被檢測(cè)系統(tǒng)捕獲。理論上，每合成一條新鏈，就會(huì)水解一個(gè)探針分子，產(chǎn)生一個(gè)熒光單元，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物的形成同步。
 

　　TaqMan探針法的優(yōu)勢(shì)是特異性高。只有引物和探針同時(shí)與目標(biāo)序列正確結(jié)合，才能產(chǎn)生熒光信號(hào)，極大地避免了非特異性擴(kuò)增的干擾。同時(shí)，由于不同探針可標(biāo)記不同波長(zhǎng)的熒光基團(tuán)，該方法支持多重定量，即在同一反應(yīng)管中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)不同的目標(biāo)基因。
 

 

　　四、技術(shù)應(yīng)用
 

　　1.基因表達(dá)分析
 

　　可以用于基因表達(dá)與調(diào)控研究，利用該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)不同時(shí)間點(diǎn)或不同處理?xiàng)l件下目標(biāo)基因的表達(dá)量的定量測(cè)量，進(jìn)而探究基因的功能和調(diào)控機(jī)理，以及生物發(fā)育、疾病診斷等領(lǐng)域中的應(yīng)用。
 

　　2.微生物檢測(cè)
 

　　可以在不需要生長(zhǎng)或培養(yǎng)微生物的情況下，通過在其核酸序列上進(jìn)行PCR反應(yīng)和熒光定量來檢測(cè)微生物的存在和含量。這種方法比傳統(tǒng)培養(yǎng)法更快、更靈敏和更準(zhǔn)確。
 

　　3.進(jìn)化研究
 

　　可以用于研究特定DNA序列的變異和多態(tài)性，并確定DNA序列的起源和進(jìn)化方向。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物系統(tǒng)進(jìn)化、物種鑒定和親緣關(guān)系等領(lǐng)域中。
 

　　4.腫瘤診斷
 

　　可以用于診斷某些腫瘤的存在和發(fā)展。比如可以在患者血液、組織和體液等樣品中檢測(cè)癌細(xì)胞的DNA或RNA，在早期檢測(cè)和治療方面有重要的臨床價(jià)值。
 

　　五、注意事項(xiàng)
 

　　1.PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)化
 

　　PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)于結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性十分重要。需要根據(jù)反應(yīng)目的和所需的特定樣品的特征對(duì)PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。
 

　　2.選擇合適的引物和熒光探針
 

　　引物的設(shè)計(jì)應(yīng)該充分考慮基因序列的一些特異性區(qū)域，特別是SNP和Indel的分布，避免出現(xiàn)位點(diǎn)失配。而熒光探針的類型應(yīng)該根據(jù)技術(shù)的目的和反應(yīng)特點(diǎn)進(jìn)行選擇。
 

　　3.樣品的制備和保存
 

　　樣品制備和保存的方式應(yīng)該依據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩āＬ貏e要注意的是，樣品在制備和保存過程中避免受到污染和退化。
 

　　4.充分掌握數(shù)據(jù)分析和結(jié)果解讀的技巧和方法
 

　　結(jié)果不能僅僅從熒光曲線和計(jì)數(shù)得到，還需要進(jìn)行基因表達(dá)、SNP分析和組織分析等一系列的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。需要充分掌握數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)技巧。
 

　　總之，qPCR技術(shù)已成為生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域中DNA、RNA檢測(cè)和定量的主要手段之一，更加便捷、靈敏、準(zhǔn)確。但仍需注意技術(shù)細(xì)節(jié)和數(shù)據(jù)分析，避免出現(xiàn)誤差和失誤。隨著該技術(shù)不斷的完善和應(yīng)用，相信它將更加發(fā)揮其重要性。